海洋细菌Ponticoccus sp.PD--2群体感应系统及对抑藻功能的调控探究
海洋环境中的溶藻细菌是一类对海洋微藻的生长具有抑制作用,或直接杀死藻细胞的细菌.研究溶藻细菌的功能与机制是藻菌作用关系的热点问题,对探讨赤潮的生物治理等关键科学问题具有重要的指导意义.本文以一株微藻共栖细菌Ponticoccus sp.PD-2为研究对象,研究了其群体感应系统,利用CRISPR/CAS9技术成功敲除群体感应基因zlaI和zlbI,探明了其抑藻活性和群体感应之间的联系,主要研究内容包括:本文对PD-2的基因组序列进行分析,发现了两对群体感应基因(luxI/R同源基因),命名为zlaI/R和zlbI/R.通过构建系统发育树和多重蛋白序列比对分析,发现这两对群体感应调控蛋白与其他菌种对应蛋白的同源性较高,高于69%,且luxI同源蛋白的氨基酸序列高度保守.利用生物传感器和GC-MS检测PD-2产生的AHLs信号分子的数量和种类,发现该菌至少可以产生两种AHLs分子,分别为OC8-HSL和OC10-HSL.分别克隆zlaI和zlbI基因并连接表达栽体pGEX-6P-1,在大肠杆菌E.scherichia coli BL21中高效异源表达,生物自显影的方法证实两个luxI同源基因均能合成OC8-HSL和OC10-HSL两种信号分子,其中OC8-HSL主要由zlbI调控合成.本文通过抑藻实验发现,PD-2的代谢产物对三种赤潮藻(东海原甲藻,棕囊藻,塔玛亚历山大藻)的生长有明显的抑制作用,对其宿主东海原甲藻的抑制作用最强.我们通过向PD-2培养液中加入AHLs信号分子抑制剂β-环糊精后,发现PD-2信号分子的含量明显减少.通过抑藻实验发现,AHLs信号分子减少后PD-2的藻活性也降低了50%-80%,说明淬灭QS系统后可以影响PD-2中抑藻物质的产生.本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功敲除了PD-2中的两个AHLs合成酶基因zlaI和zlbI,实现了CRISPR/CAS9在海洋细菌中的应用.后对PD-2zlaI和zlbI缺失突变体进行了AHLs分子及抑藻活性检测,实验结果表明敲除luxI同源基因的PD-2不再产生AHLs信号分子,同时其抑藻功能消失,该结果进一步从分子水平证明了PD-2的抑藻活性受群体感应系统的调控.
- 作者：
- 迟雯丹
- 学位授予单位：
- 国家海洋局第一海洋研究所
- 专业名称：
- 海洋生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2017年
- 导师姓名：
- 郑立
- 中图分类号：
- Q78；X55
- 关键词：
- 微藻共栖细菌；群体感应；抑藻活性；CRISPR-CAS9；基因敲除
- Microalgae-associated bacteria； Quorum Sensing； Agicidal activity； CRISPR-CAS9； Gene knockout